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タンパク質高発現細胞作製

TOPICS・キャンペーン情報

  • 2013/11/07
    【お試しキャンペーン】『蛋白質高発現試薬 TG-Sure Expression (IR/MAR)』の小スケール品 数量限定販売は終了しました。
  • 2012/02/01
    【半額キャンペーン】IR/MAR遺伝子増幅法DNA試薬 終了しました
  • 2011/11/01
    新製品(IR/MAR遺伝子増幅法DNA試薬)の販売を開始しました
  • 2010/09/01
    タンパク質高発現細胞作製サービス開始のお知らせpdf
タンパク質発現

タンパク質高発現細胞作製


トランスジェニック社では、IR/MAR(アイアール・マー)遺伝子増幅法dhfr/MTx遺伝子増幅法によるタンパク質発現受託サービスをご提供しております。

哺乳動物細胞を宿主としたタンパク質発現系は、適切な立体構造や翻訳後修飾を必要とするようなタンパク質の生産の目的で利用されています。しかしながら、他のタンパク質発現系と比べて、哺乳動物によるタンパク質発現系の生産性は決して高いものではありません。このため、タンパク質の高い生産性が要求される場合では、遺伝子増幅法によるタンパク質発現細胞の構築が行われています。遺伝子増幅法で構築したタンパク質発現細胞では、多コピーに増幅された目的遺伝子が染色体上に導入されます。


IR/MAR遺伝子増幅法は、癌細胞株で見られる遺伝子増幅メカニズムの研究過程において発見された新しい原理に基づく遺伝子増幅技術です。哺乳動物複製開始領域 (IR)と核マトリックス結合領域 (MAR) を持つプラスミドは、細胞内で効率よく遺伝子増幅を起こします。従って、本品(IR/MAR 配列を持つDNA)と共に発現ベクターを適当な宿主細胞株にトランスフェクションすることにより、遺伝子増幅された発現株を作製することができます。トランスフェクション後は通常の薬剤選抜により、安定発現株を取得することができます。

サービス内容につきまして、その概要をダウンロード頂けます。

TG-Sure Expression [1.8MB]

動物細胞における、タンパク質高発現細胞株の樹立にお困りなら、今すぐご相談下さい

IR/MAR遺伝子増幅法

特徴

早くて簡単、どの細胞でも、タンパク質を高発現 できる!
・新しい原理の遺伝子増幅法により、タンパク質の高発現細胞を迅速に構築できます
・豊富な技術ノウハウに基づく受託サービスをご提供します
・お客様自身で実施できる試薬製品TG-Sure Expression (IR/MAR)も販売しております

原理

広島大学生物圏科学研究科の清水典明教授らによって発見された方法で、複製開始領域(Initiation Region…IR)と核マトリックス結合領域(Matrix Attachment Region…MAR)と呼ばれる特殊な配列と発現プラスミドを培養細胞に共導入します。これによって発現プラスミドに含まれる遺伝子が効率的に増幅され、Double Minutes(DMs)様の構造やHomogeneously Staining Region(HSR)を形成します。ゲノム上で多コピーとなった目的遺伝子によって目的タンパク質の発現量が飛躍的に増大します。この方法は細胞株を選ばず、お客様が指定する任意の細胞株によってタンパク質高発現株を作製することが可能です。

原理

< 参考文献 >
■Cancer Res 61, 6987–6990, 2001
Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplification.
Noriaki Shimizu, Yuri Miura, Yu Sakamoto and Ken Tsutsui

■Cancer Res 63, 5281–5290, 2003
Amplification of plasmids containing a mammalian replication initiation region is mediated by controllable conflict between replication and transcription.
Noriaki Shimizu, Toshihiko Hashizume, Kenta Shingaki and June-ko Kawamoto

■Exp Cell Res 302(2), 233-243, 2005
When, where and how the bridge breaks: Anaphase bridge breakage plays a crucial role in gene amplification and HSR-generation.
Noriaki Shimizu, Kenta Shingaki, Yukiko Kaneko-Sasaguri, Toshihiko Hashizume and Teru Kanda

■J Cell Biochem 101, 552-565, 2007
Dissection of Mammalian Replicators by a Novel Plasmid Stability Assay.
Toshihiko Hashizume and Noriaki Shimizu

■Nucleic Acids Research, 39(3), 958-969, 2011
Amplification of a plasmid bearing a mammalian replication initiation region in chromosomal and extrachromosomal contexts.
Saiyu Harada, Naoki Sekiguchi, and Noriaki Shimizu

■Protein Expression and Purification 80, 41-46, 2011
High-level expression of human recombinant cyclooxygenase-1 in mammalian cells using a novel gene amplification method.
Hiromitsu Yoshimura, Shingo Sekine, Hisashi Adachi, Yoshikatsu Uematsu, Akiko Mitani, Nobuko Futaki, Noriaki Shimizu

■PLoS one, 2012
Efficient Recombinant Production in Mammalian Cells Using a Novel IR/MAR Gene Amplification Method
Yoshio Araki, Tetsuro Hamafuji, Chiemi Noguchi, Noriaki Shimizu

実施例1 HEK293を用いたタンパク質発現

HEK293を用いた場合(当社で実施)

およそ8.5kbpの遺伝子をIR/MAR配列とともに共導入、タンパク質高発現株を作製しクローン化した。
発現しているタンパク質は活性を有しており、IR/MAR配列を含まないコントロールと比較した場合、高発現細胞株は活性を有するタンパク質の発現が6倍以上であることが認められた。

HEK293を用いた場合(当社で実施)

実施例2 CHO細胞を用いたタンパク質発現

CHO細胞を用いた場合(データ提供:広島大学大学院 生物圏科学研究科 清水典明教授)

抗体遺伝子とIR/MAR配列を共導入して、高発現細胞株を作製した。IR/MAR配列を含まないコントロールと比較した場合、高発現細胞株は30倍以上の抗体の発現が認められた。

CHO細胞を用いた場合(データ提供:広島大学大学院 生物圏科学研究科 清水典明教授)

実施例3 COLO320DM細胞を用いたタンパク質発現

COLO320DM細胞を用いた場合(データ提供:広島大学大学院 生物圏科学研究科 清水典明教授

抗体遺伝子とIR/MAR配列を共導入して、高発現細胞株を作製した。IR/MAR配列を含まないコントロールと比較した場合、高発現細胞株は8倍以上の抗体の発現が認められた。

COLO320DM細胞を用いた場合(データ提供:広島大学大学院 生物圏科学研究科 清水典明教授

価格


○タンパク質発現受託サービス

工程 内容 標準期間 価格(税別)
合計
1,600,000円~

[ アカデミア価格
  900,000円~ ]
1. 遺伝子導入 ・TG-Sure Expression (IR/MAR)と目的遺伝子の発現
のトランスフェクション
・薬剤耐性株の樹立
・遺伝子発現の確認
6~8週間
800,000円~

[ アカデミア価格
  450,000円~ ]
2. 高発現細胞クローンの単離 ・薬剤耐性株のクローニング
・高発現株のスクリーニング
・タンパク質発現の確認
4~6週間
800,000円~

[ アカデミア価格
  450,000円~ ]

※発現クローンの培養、蛋白質の精製につきましても、別途ご相談ください。
※CHO細胞では、浮遊無血清培養への馴化も承ります。


○試薬製品


タンパク質発現

品名 容量 価格(税別) 添付文書 ライセンス
確認同意書
蛋白質高発現試薬 TG-Sure Expression (IR/MAR) 10 μg \112,500   (270KB)   (94KB)

※発現ベクターと共にコ・トランスフェクションしていただくことにより、遺伝子増幅された発現株を取得することができます。
※本製品の使用は、ご購入者の自施設における研究目的に限られています。
※本製品の複製、または第三者への譲渡・配布・再販はご遠慮ください。

※本製品のご購入の際には、別途、ライセンス確認同意書のご提出をお願いしております。
  上記のpdfをダウンロード印刷し、ライセンス条項を十分ご確認ください。

※ご発注にあたってはライセンス確認同意書の必要事項をもれなくご記入の上、販売店にお渡しください。

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dhfr/MTx遺伝子増幅法

特徴

・医薬品製造に用いられているチャイニーズハムスター卵巣由来(CHO)/DG44株で実施
・MTx濃度を1~5μMまで上昇させ、安定発現株を納品
・納品まで3~5ヶ月

原理

ジヒドロ葉酸リダクターゼを欠損したチャイニーズハムスター卵巣由来細胞株CHO/DG44は培地中にチミジンとヒポキサンチンを要求する細胞株です。その細胞株にdhfr遺伝子と目的遺伝子を共導入します。そこにDHFRの拮抗阻害剤であるメトトレキセート(メトトレキサート/メソトレキセート…MTx)を段階的に加えることで、目的遺伝子が増幅され高発現株を取得することができます。この方法は医薬品の生産の現場で最も頻繁に用いられている方法の1つです。

実施例(当社で実施)

抗体遺伝子とdhfrを含む配列を共導入し、段階的にMTx濃度を上げて高発現株の作製を行った。MTx濃度を1,000nMまで上げた場合の発現量は無処理の場合と比較して40倍以上に上昇した。1,000nMまで濃度を上げて培養を行うのに、およそ20週間を要した。

実施例

価格

工程 内容 標準期間 価格(税別)
合計 1,600,000円~
1. 遺伝子導入 ・dhfr発現ベクターと目的遺伝子の発現ベクターを
トランスフェクション
・核酸要求性(チミジン/ヒポキサンチン)による選抜、
薬剤耐性選抜、MTX選抜
12~20週間 800,000円~
2. 高発現細胞クローンの単離 ・クローニング
・高発現株のスクリーニング
・タンパク質発現の確認
8~12週間 800,000円~

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